海藻糖凍干保護應(yīng)用分享——一種慢病毒載體凍干制劑的制備和穩(wěn)定性研究

關(guān)鍵詞：慢病毒載體，冷凍干燥，CAR-T，海藻糖，凍干保護劑

作為優(yōu)秀的凍干保護劑，海藻糖在生物醫(yī)藥制劑等相關(guān)領(lǐng)域獲得了越來越廣泛的應(yīng)用和重視。今天小編就帶您一起了解其中一項研究成果——華東師范大學(xué)沈鴻偉等關(guān)于慢病毒載體凍干制劑的制備及穩(wěn)定性的研究，以及海藻糖在其中發(fā)揮的作用。

1.引言

1.1慢病毒載體（Lentiviral Vector， LV）

慢病毒載體（Lentiviral Vector， LV）是以人類免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，并可以在體內(nèi)長期穩(wěn)定表達。

目前腫瘤免疫治療兩大主流的過繼性細胞療法包括TCR-T和CAR-T細胞療法，其中慢病毒載體（LV）已被廣泛應(yīng)用。CAR-T細胞生產(chǎn)環(huán)節(jié)中包括以攜帶目的基因的慢病毒載體感染T細胞，其中慢病毒的滴度對感染是否成功非常關(guān)鍵。

由于慢病毒載體由蛋白質(zhì)和核酸組成，導(dǎo)致其儲存條件遇到了與其他生物制品類似的局限性。比如其通常無法在常溫及4℃冷藏條件下長時間保存，熱穩(wěn)定性差，同時反復(fù)凍融也會降低其滴度。

目前尚無理想的慢病毒載體凍存保護液，-80℃冷凍保存或加入甘油保護劑也不能有效防止慢病毒載體在儲存過程中滴度降低。此外慢病毒載體在運輸時需要采用低溫冷鏈運輸，增加了運輸成本，且無法規(guī)避運輸帶來的風(fēng)險。

1.2冷凍干燥

冷凍干燥（Lyophilization）全稱真空冷凍干燥，簡稱凍干，是在低溫減壓條件下，利用水的升華使制品低溫脫水而達到干燥的一種技術(shù)。凍干在低溫低氧條件下進行，多數(shù)生物反應(yīng)停滯，且處理過程無液態(tài)水存在，使物料原有結(jié)構(gòu)和形狀得到大程度的保護。通過凍干獲得的粉體硬團聚少，粒徑小且均勻，已經(jīng)成為制備生物制品，尤其是蛋白多肽類粉針劑的一種重要方法。

2.研究目標(biāo)

該研究旨在利用凍干技術(shù)，選取慢病毒載體，探索出適合病毒類載體儲存的凍干保護劑型，同時制備得到新型的慢病毒載體凍干制劑，通過篩選慢病毒載體凍干保護劑處方，并以正交實驗設(shè)計（DOE）的方法進行處方優(yōu)化，制備得到外觀良好、生物滴度高的慢病毒載體凍干制劑，使得該制劑在常溫下具有較長的保質(zhì)期，并且能夠在高溫高濕的條件下依然保持較高的生物活性。

3.研究結(jié)果

3.1慢病毒載體凍干制劑制備的可行性分析

使用流式細胞（FACS）和實時熒光定量核酸擴增檢測（QPCR）的方法考察慢病毒載體的生物滴度，實驗結(jié)果如圖1所示。

比較凍干保護劑與HBSS對于慢病毒載體在–80 ℃ 凍存以及凍干過程中的影響，同時對比凍存前后以及凍干前后對慢病毒滴度的影響，實驗結(jié)果表明，在凍干的過程中，凍干保護劑確實能夠起到保護作用，最終兩種檢測方法均測得滴度回收率。通過這兩種檢測方法可以看出慢病毒載體凍干制劑制備具有可行性。

3.2慢病毒載體凍干保護劑處方的篩選

為篩選適用于慢病毒載體的凍干保護劑處方，從菌種凍干、脂質(zhì)體凍干、蛋白質(zhì)凍干 (包括減毒活疫苗類)、其他病毒類凍干（腺病毒等）選定了5組基本的凍干保護劑（含1組對照組）進行研究分析：

采用以上5組處方進行慢病毒載體凍干保護劑處方篩選，以凍干產(chǎn)品的外觀、色澤和復(fù)溶性為指標(biāo)綜合評價其理化性質(zhì)，考察了各種凍干保護劑對凍干產(chǎn)品的保護作用，結(jié)果見下表：

5組凍干保護劑處方的慢病毒載體滴度回收率結(jié)果如圖2所示。

從圖2(a)中可以看出，Ⅱ組的凍干保護劑處方保護效果佳，加入Ⅱ組的凍干保護劑處方后制備得到的慢病毒載體凍干制劑，感染細胞后通過QPCR的方法檢測得到的滴度值最高；圖2(b)顯示，Ⅱ組慢病毒載體的滴度回收率最佳，兩圖相符合，無論在冷凍保存條件下還是在真空冷凍干燥后，Ⅱ組的凍干保護劑的效果均最好，所以選擇以Ⅱ組保護劑為基礎(chǔ)進行優(yōu)化。根據(jù)多響應(yīng)預(yù)測結(jié)果，確定*的凍干保護劑處方為15g海藻糖、8.9mg L-丙氨酸、15.5mg L-組氨酸、1.0 mg CaCl2、0.76 mg MgSO4。

3.3慢病毒載體凍干制劑穩(wěn)定性研究

使用QPCR檢測慢病毒載體凍干制劑和凍存制品的生物滴度 (IU/mL)，對生物滴度值取 lg 對數(shù)函數(shù)，以lgT對時間t做圖，結(jié)果可參見圖4。

結(jié)果表明，慢病毒載體在冷凍干燥以后可以實現(xiàn)較長時間的保存，但是生物滴度值會下降，說明在儲存時也會緩慢失活。但是在4 ℃及23℃保存的條件下慢病毒載體凍干制劑均更加穩(wěn)定（圖4a及圖4c），凸顯了其儲存優(yōu)勢。

使用QPCR檢測慢病毒載體凍干制劑和凍存制品反復(fù)凍融后的生物滴度 (IU/mL)，結(jié)果可參見圖5。

可以看出反復(fù)凍融對于慢病毒載體凍干制劑的影響并不明顯，隨著反復(fù)凍融次數(shù)的增加，慢病毒滴度能維持穩(wěn)定；然而對于慢病毒載體凍存制劑而言，反復(fù)凍融的影響顯著，表明慢病毒凍干制劑在反復(fù)凍融的條件下更加穩(wěn)定，可以實現(xiàn)反復(fù)凍融5~6次，顯著改善了液體制劑反復(fù)凍融導(dǎo)致的活性損失等問題。

4.討論與總結(jié)

4.1凍干保護劑的選擇

凍干保護劑主要可分為以下幾類:一般為多羥基化合物、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、聚合物和無機鹽等化合物。因為凍干保護劑不但要具有保護生物制品活性的效果和結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，而且要具有凍干賦形的作用。

糖是一種使用廣泛的凍干保護劑，本研究中采用的海藻糖屬于二糖，比蔗糖具有更低的吸濕性和更高的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度，其羥基能替代水分子與蛋白質(zhì)分子表面部分結(jié)合，而且海藻糖分子較小，能填充到蛋白質(zhì)分子的空隙中，有效地限制蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在凍干時可以對慢病毒的蛋白衣殼形成保護，因此凍干制劑保護效果更好。

氨基酸具有酸性羧基和堿性氨基，能夠調(diào)節(jié)制品溶劑環(huán)境的pH值，不同類別的氨基酸具有不同的親水性功能，而親水性強的氨基酸較易與蛋白質(zhì)產(chǎn)生氫鍵，這對蛋白質(zhì)在凍干的過程中的穩(wěn)定性和活性具有重要的保護作用，如組氨酸、丙氨酸等，可以增加慢病毒載體包膜蛋白和組氨酸磷酸鹽緩沖液間的張力，提高慢病毒載體包膜蛋白水化水平。而加入二價陽離子類，如CaCl2和MgSO4這兩種無機鹽，可延遲海藻糖結(jié)晶，通過和磷酸根陰離子存在下氫鍵網(wǎng)絡(luò)以及分子遷移率的變化抑制結(jié)晶。

4.2總結(jié)

該研究給出了一種新型的慢病毒載體凍干制劑的制備方法。通過研究凍干保護劑的組分篩選與優(yōu)化、凍干產(chǎn)品的制劑學(xué)研究和穩(wěn)定性研究，表明凍干技術(shù)對于慢病毒載體的儲存帶來了新的突破。

在*凍干保護劑處方的條件下，慢病毒載體凍干制劑能夠?qū)崿F(xiàn)儲存時間長、運輸過程簡便、穩(wěn)定性提高的優(yōu)點，為CAR-T細胞免疫治療的進一步推廣提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

這其中，作為凍干保護劑主要成分的海藻糖發(fā)揮著不可替代的作用，提示海藻糖作為一種新興的凍干保護劑具有廣闊的應(yīng)用前景與市場價值。

參考文獻：

華東師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2021年5月第三期，沈鴻偉，李明昊，徐南等，慢病毒載體凍干制劑的制備與穩(wěn)定性研究。